Ligasi dan Transformasi Bakteri

Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. DNA yang akan disisipkan biasanya disambungkan dengan vektor pengklonan. Dalam proses penggabungan (ligasi) antara dua molekul DNA memerlukan enzim sebagai perekat. Ada dua enzim yang biasa digunakan untuk menggabungkan antara dua molekul DNA, yaitu 1) enzim yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4, oleh karena itu enzim tersebut dinamakan T4 DNA ligase, 2) enzim yang dihasilkan oleh E. coli sendiri disebut dengan E. coli DNA ligase. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi yang sama yaitu mensintesis pembentukan ikatan fosfodiester yang menghubungkan nukleotida di sebelahnya. Perbedaannya adalah pada kofaktor yang membantu reaksi pembentukan ikatan tersebut. Kofaktor untuk T4 DNA ligase adalah ATP, sedangkan untuk E. coli DNA ligase adalah NAD+ (Pasternak&Bernard 2003). Pada praktikum kali ini enzim ligase yang digunakan adalah T4 DNA Ligase.

            Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Metode transformasi ini pertama kali dikembangkan untuk memindahkan sifat-sifat genetika yang membawa kenyataan bahwa DNA adalah bahan genetika. Meskipun transformasi telah dieksploitasi untuk mempelajari pautan gen pada berbagai organisme, metode ini sekarang secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid-plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya. Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel (Lodishet al 2000).

Setiap sel termasuk bakteri memiliki sistem pertahanan diri terhadap benda asing termasuk DNA. Jika sel bakteri menemukan adanya DNA asing, maka enzim restriksi sebagai penjaga benteng akan memotong-motong DNA tersebut hingga menjadi pendek dan tak berfungsi lagi. Agar DNA plasmid yang ditransformasi tidak dicincang oleh enzim restriksi, maka ia harus memiliki bagian yang dinamakan ori atau origin of replication yang dikenali oleh bakteri yang bersangkutan. Ori ini berfungsi mengelabui bakteri agar tidak menganggapnya sebagai DNA asing. Ori juga merupakan signal agar bakteri tersebut melakukan replikasi DNA plasmid secara independen seiring dengan replikasi DNA genomnya(Wibowo 2002).

Untuk membedakan antara bakteri yang sudah dimasuki DNA plasmid dan yang tidak, umumnya digunakan  seleksi antibiotik. Umumnya bakteri tidak dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik. Untuk itu pada DNA plasmid yang kita transformasikan harus ada gen penyandi antibiotik resisten agar bakteri hostnya menjadi tahan hidup di media yang mengandung antibiotik. Jadi, bakteri yang tidak berhasil disusupi oleh plasmid akan mati dengan sendirinya(Sambrook&Russel 2001).

Untuk membedakan antara bakteri yang plasmidnya memiliki insert atau tidak. Insert biasanya disisipkan di pertengahan gen lacZ yang merupakan penyandi enzim ß-galactosidase. Enzim ini dapat memecah substrat X-gal (suatu galaktosa yang dimodifikasi) menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5′-dibromo-4,4′-dichloro-indigo yang berwarna biru. Jika gen LacZinimasihutuh, maka koloni bakteri akan berwarna biru akibat pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Tetapi jika insert berhasil disisipkan (diligasikan) dengan vektor, sehingga gen lacZ-nya akan terdisrupsi (rusak) dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni bakteri akan berwarna putih. Jadi hanyakoloni putih yang tumbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal saja yang kemungkinan mengandung gen yang kita transformasikan. Inilah yang dinamakan seleksi biru-putih (Sambrook&Russel 2001).

Berdasarkan hasil pengamatan, dapat dilihat bahwa pada keempat cawan petri dengan empat perlakuan yang berbeda, akan menunjukkan hasil yang berbeda pula. Kontrol positif (sel kompeten+LA) menunjukkan pertumbuhan koloni sel yang sangat banyak dan berwarna putih. Kontrol negatif (sel kompeten+LA+AMP) tidak menunjukkan adanya pertumbuhan koloni sel. Kontrol aktivitas X-Gal+IPTG(Sel+LA+IPTG+X-Gal) menunjukkan pertumbuhan koloni sel berwarna biru. Kontrol transformasi (hasil transformasi kelompok 5 yang terdiri dari sel kompeten hasil ligasi+LA+AMP+X-Gal+IPTG) menunjukkan semua koloni sel yang berwarna putih. Berdasarkan penjelasan literatur di atas tentang seleksi biru-putih, menunjukkan bahwa dari hasil percobaan tersebut telah menunjukkan adanya keberhasilan transformasi dan ligasi DNA(Sambrook&Russel 2001).

Simpulan

            Kontrol transformasi (hasil transformasi kelompok 5 yang terdiri dari sel kompeten hasil ligasi+LA+AMP+X-Gal+IPTG) menunjukkan semua koloni sel yang berwarna putih. Hal ini menunjukkan bahwa insert berhasil disisipkan (diligasikan) dengan vektor, sehingga gen lacZ-nya akan terdisrupsi (rusak) dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni bakteri akan berwarna putih

Daftar pustaka

Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B. 2000. Molecular Cell Biology. New York: Wh Freeman Company

Pasternak JJ, Bernard RG. 2003. Molecular Biotechnology: Principle and Appplication of Recombinant DNA. Washington DC: ASM Press.

Sambrook J,Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Wibowo M. 2002. Tranformasi fragmen DNA kromosom Xanthomonas campestriskedalamEscherichia coliJ Makara Sains6(1): 21-24.

About herumu512

Hamba Allah swt, Pengembara, Pencari dan Pengajar Ilmu

Posted on March 2, 2013, in Science and tagged . Bookmark the permalink. Leave a comment.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: