Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi dan Isolasi(Elusi) Fragmen DNA Plasmid dari Gel Agarose

Tahun 1960, seorang ahli genetika bernama Warner Arber dan Hamilton Smith menemukan sebuah enzim yang dapat digunakan untuk memotong DNA utas ganda. Enzim tersenut sekarang dikenal dengan enzim endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens yang spesifik yang panjangnya antara 4 sampai dengan 6 pasang basa. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi dinamakan sekuens pengenal. Sekuens pengenal adalah suatu nukleotida(urutan basa) yang dikenali oleh enzim restriksi sebagai situs tempat pemotongannya (Joung 2000).

Kerja enzim tersebut dalam tubuh inangnya adalah mengenali dan memotong DNA (termasuk DNA faga tertentu) yang asing bagi bakteri tersebut. Maksud dari kegiatan memotong DNA asing tersebut tidak lain sebagai mekanisme perlindungan bakteri terhadap DNA yang menyelinap dari organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain. Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-motong DNA pada lokasi-lokasi yang spesifik- mengenali daerah atau urutan DNA pendek dalam molekul DNA dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat PALINDROME. Selanjutnya enzim tersebut akan memotong DNA pada titik tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau “Blunt end” dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau “sticky end”. Dengan memanfaatkan kerja enzim kita dapat membuat peta restriksi dari suatu molekul DNA(glick 1989).

Enzim restriksi yang biasa digunakan sekarang adalah enzim EcoR1 yang telah diisolasi oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Eschericia coli. Enzim EcoR1 ini memutus/ memotong DNA pada bagian urutan basa GAATTC (sekuens pengenal bagi Enzim ecoR1 adalah GAATTC). Enzim ini memotong tidak pada sembarang tempat tapi diantara basa G dan A(Guanin dan Adenin)( Joung 2000)

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya. Fragmen tersebut berfungsi untuk pelacak gen DNA lain dan bisa untuk divangkokkan ke fragmen DNA yang lain. Kegiatan untuk mendapatkan fragmen murni tersebut dapat melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi, kemudian dilanjutkan dengan elektroforesis pada gel. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan apabila telah ditemukan gel yang mengandung fragmen tersebut dipotong. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat (George 2001)

Percobaan dengan isolasi fragmen DNA plasmid  diperoleh hasil yaitu tidak terdapat DNA yang tumbuh ini lebih dikarenakan pada saat pengmbilan DNAny.hanya sedikit dan bahkan tidak ada DNA yang terbawa, dan saat penyaringan oleh nylon hybond. Percobaan dengan pemotongan DNA oleh enzim restriksi diperoleh dua DNA yang terpisah yang menunjukan keberhasilan pada proses pemotongan. atau tidak sesuai.

Percobaan ini menggunakan DNA dari bakteri Eschericia coli dan enzim restriksi berupa EcoR1. Hasil pemotongan enzim restriksi ada dua jenis. Hasil pemotongan yang menghasilkan ujung tumpul atau “Blunt end” dan hasil pemotongan yang menghasilkan ujung lancip/ lengket atau “sticky end”. Dengan memanfaatkan kerja enzim kita dapat membuat peta restriksi dari suatu molekul DNA.

Percobaan ini menggunakan beberapa larutan yaitu NaOAC, etanol, TAE dan H2O. larutan NaOAC dan Etanol iniberfungsi untuk pemurni DNA. H2O berfungsi sebagai larutan pelarut. Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs spesifik. Seperti diketahui, di dalam Bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang berperan dalam proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA rekombinan (di mana dua molekul DNA dikombinasikan). DNA spesifik atau gen diisolasi/diambil dari DNA dengan memotong sugar–phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur dan dikombinasi (George 2001).

Daftar pustaka

George SP. 2001. Molecular and Biochemical Aspects of Extremophilic Actinomycete     [Thesis]. India: Division of Biochemical Sciences National Chemical Laboratory Pune

Glick BR. 1989. Molecular Biotechnology Principles and Application of Recombinant DNA. Washington: ASM Press

Joung J. 2000. “A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions”. Proc Natl Acad Sci USA 13:7382–7387

About herumu512

Hamba Allah swt, Pengembara, Pencari dan Pengajar Ilmu

Posted on February 17, 2013, in Science and tagged . Bookmark the permalink. Leave a comment.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: